 |
 |
|
Inleiding histologie In tegenstelling tot plantenweefsel is het snijden van dierlijk weefsel veel lastiger. Dierlijke weefsels laten zich niet zo eenvoudig snijden. Het materiaal is te week en vervormt gemakkelijk. Bovendien mogen coupes (plakjes) ten hoogste 10 µm (µm = 1/1000 mm) dik zijn willen ze geschikt zijn voor bestudering. Zoals plantenweefsel celwanden bezit heeft dierlijk weefsel geen celwand, het is daarom niet contrastrijk. Kleuring van het preparaat zal daarom altijd nodig zijn. Om de vervalprocessen te stoppen zal dierlijk weefsel altijd moeten worden gefixeerd. De structuur van het weefsel blijft ongeveer gelijk, maar chemisch verandert er veel. Het weefsel wordt wat harder, maar snijden is nog steeds niet goed mogelijk. Het weefsel is stroef. Het gaat bovendien vaak om kleine stukjes materiaal, die bijna niet vast te houden zijn. Een goede oplossing voor het snijden is het gebruik van paraffine. Deze stof laat zich heel goed bewerken maar heeft een groot nadeel n.l. het is niet oplosbaar in water en bijna alle dierlijke weefsels bestaan voor een groot gedeelte uit water. Om die reden wordt in verschillende stappen (50% ethanol, 70% ethanol, 85% ethanol, 96% ethanol en 100% isopropanol) het water verdreven door alcohol (dehydratie). Nadat alle water door alcohol is verdreven wordt de alcohol op z'n beurt weer verdreven door een stof genaamd: xylol of xyleen. Deze stof is wel oplosbaar in paraffine. Nadat tenslotte alle xylol verdreven is door paraffine kan het weefsel worden ingegoten tot een blokje paraffine. Het ingegoten weefsel kan nu op een microtoom worden gesneden tot dunne coupes. Wanneer gebruik gemaakt wordt van een handmicrotoom is dat de stap die in de praktijk de meeste problemen op zal leveren. Met veel geduld en veel oefening zullen er uiteindelijk prachtige coupes gesneden kunnen worden. De flinterdunne coupes worden op een voorwerpglaasje geplakt met een eiwit/glycerol mengsel. Om het preparaat te kunnen kleuren zal alle paraffine eerst uit de coupes moeten worden verwijderd omdat de meeste kleurstoffen op een waterige basis zijn. Dit 'hydrateren' gebeurt in omgekeerde volgorde zoals boven beschreven dus, eerst wordt met behulp van xylol de paraffine verwijderd en daarna wordt via een dalende alcoholreeks een waterige omgeving bereikt. Nu kunnen diverse kleurmethodes worden toegepast. Na het kleuren kan het preparaat in principe bekeken worden maar zal het na een paar uur of dagen niet meer 'goed' zijn. Water maakt namelijk bederf mogelijk, aangezien er micro-organismen in kunnen leven. Inbedden in (kunst)hars maakt preparaten zeer lang (decennia tot eeuwen) houdbaar. De kunsthars die hiervoor wordt gebruikt laat zich niet in water oplossen zodat het preparaat opnieuw ontwatert moet worden. Hiervoor wordt opnieuw een stijgende alcoholreeks toegepast (50% ethanol, 70% ethanol, 85% ethanol, 96% ethanol en 100% isopropanol) die meestal eindigt in een xylol omgeving. Nu kan de kunsthars worden opgebracht waarna een dekglaasje het preparaat definitief afsluit. Het preparaat kan al wel worden bestudeerd maar het duurt nog enkele weken voordat de hars volledig is uitgehard. Laatste fase bestaat uit het wegkrabben van overtollig hars en het aanbrengen van een etiket. De volgende tekst gaat dieper in op de histologie. Histologie Wat is histologie? Histologie betekent letterlijk, weefselleer. Om met een lichtmicroscoop dierlijke weefsels zoals long, hart of nieren op celniveau te kunnen bestuderen is het noodzakelijk om het weefsel eerst te fixeren (stoppen van chemische processen), er zeer dunne plakjes van te snijden, ze op een stevige ondergrond te bevestigen, ze op speciale manieren te kleuren en bovendien "houdbaar" te maken. Er is dan een z.g. preparaat gemaakt. Het maken van een preparaat, dat later bestudeerd kan worden, wordt histologische techniek genoemd. Dit hele proces wordt bijna altijd in een vast patroon afgewerkt. Het histologieproces.
1. Weefsel uitnemen Van groot belang is dat weefsel vers is. Na de dood begint het vervalproces zeer snel op gang te komen. Een stuk orgaan gekocht in de supermarkt is voor microscopisch onderzoek niet meer geschikt, het vervalproces is te ver gevorderd. Er zijn diverse andere manieren om aan weefsels te komen. - In het verkeer verongelukte dieren (egels, vogels). - Sommige mensen zetten vallen voor muizen. - Verse slachtmaterialen. - Vers gevangen vissen. - Restweefsels van practica op scholen. - Eigen operatiematerialen (meniscus, kies). - Uw huisdier kan ook geopereerd zijn (knobbeltje verwijderd). - Een stukje huid dat losraakt bij een verwonding. Het is niet zinvol om een dood dier compleet te conserveren. Voor de histologische technieken die hier beschreven worden zijn stukjes weefsel (spier, huid, hart, lever, nier, hersenen etc.) nodig van enkele mm tot ongeveer een cm maximaal. Grotere stukken zijn niet goed (niet snel genoeg) te fixeren en zullen dus gedeeltelijk vervallen. Als er een plakje uit een orgaan wordt gesneden, maak dan een schets van de plaats en de richting. Wat uiteindelijk te zien zal zijn in een preparaat hangt daar sterk vanaf. Maak een werktafel en leg alle materialen en gereedschappen klaar. Het dode dier kan het best op een stuk stevig plastic gelegd worden. Draag de gehele periode plastic handschoenen om mogelijke bacteriebesmettingen te voorkomen. Maak allereerst een oplossing van 9 gram keukenzout (Natriumchloride) in 1 liter water. Deze oplossing wordt "fysiologische zoutoplossing" genoemd. Deze stemt redelijk overeen met de "zoutheid" van weefselvocht. Organen en weefsel kunnen ermee gespoeld worden. Gebruik nooit kraanwater voor het spoelen van vers onderzoeksmateriaal. Door de grote verschillen in osmotische waarde zullen de cellen openbarsten. Gebruik een scalpel, pincet en een verbandschaar. Pak het vel van borst- of buikholte op en maak een incisie. De spierlaag wordt dan zichtbaar. Doe daar hetzelfde mee (bij sommige dieren, zoals vissen, lukt dit niet. Probeer dan meteen door te steken naar de buikholte). Bij de borstholte zullen de ribben doorgeknipt moeten worden. Dit kan bij kleinere dieren met een verbandschaar (b.v. muizen). Bij grotere dieren is een blik- of snoeischaar wenselijk. Bij de borstholte kan door links en rechts te knippen een soort dekseltje worden losgemaakt. Bij de buikholte kan de spierlaag open worden geduwd of kunnen er flappen worden geknipt door een dwarse opening te maken. In de borstholte zijn de longen en het hart te vinden. In de buikholte liggen doorgaans lever, maag, nieren, darmen.Pak met een pincet een orgaan vast aan een bloedvat of andere uitloper (de long bv. bij een luchtpijp) en knip het vrij. Spoel desgewenst steeds met fysiologische zoutoplossing om het zicht niet kwijt te raken door bloed. Van het verse bloed kan natuurlijk meteen een bloeduitstrijk gemaakt worden op de manier zoals hier beschreven. Snij met een nieuw scalpelmes de gewenste stukken uit de organen. Doe dit niet met een schaar, want dan wordt het weefsel kapot geknepen. Breng de stukken orgaan onmiddellijk over in een fixeeroplossing, om verder verval te voorkomen. Van belang is dat er verschillende kleine potjes met fixeer gereed staan. Doe geen twee orgaansoorten in één potje want na fixatie is het verschil nauwelijks meer zichtbaar omdat bijna alle weefsel een grijsbruine tint aannemen. Etiketteer alles met weefselsoort en datumtijdgroep. Vergeet niet de werktafel en gereedschappen grondig schoon te maken en met een ontsmettingsmiddel (b.v. ethanol, spiritus) te ontsmetten. 2. Fixeren Waarom fixeren? Met fixeren (vastleggen) stoppen we de ingewikkelde stofwisselingsprocessen en voorkomen verder verval van het weefsel. Het doel van fixeren is het op een zo identiek mogelijke manier vastleggen van de structuur die het weefsel had toen het nog in leven was. Weefsels invriezen is hier geen optie omdat levend weefsel uit ongeveer 80% water bestaat en daardoor alle cellen zouden barsten (water zet immers uit bij bevriezing). Een chemische ingreep is dus noodzakelijk. Om de fixeervloeistof de kans te geven om goed en zo snel mogelijk in te werken is het van belang dat de weefselstukken niet te groot zijn. Blokjes van 4 tot 8 mm zijn goed. Ook is het beter om het weefsel in de fixeervloeistof te hangen in plaats van op de bodem te laten liggen. Dit is te realiseren door van een stukje verbandgaas een soort theezakje te vervaardigen en deze in de vloeistof te hangen. Een groot nadeel van fixeren is dat het weefsel krimpt of juist zwelt. Ervaring leert dat hoe meer water een weefsel bevat, hoe groter de volumeverandering zal zijn. De krimp kan zo groot worden dat de epitheellaag van het onderliggend bindweefsel scheurt. Ook latere behandelingen zoals dehydrateren leidt meestal tot weefselkrimp. In totaal kan de krimp wel tot 20 tot 25% van de oorspronkelijke grootte oplopen. Er bestaan vele soorten fixatievloeistoffen die allen hun eigen voor- en nadeel hebben. De keuze van het soort fixatief is afhankelijk van: welke structuur heeft het weefsel, wat willen we in een preparaat zien en welke kleurmethode gaan we toepassen. Zo slaan alcoholen en aceton eiwitten goed neer door dehydratie en denaturatie, maar nucleïnezuren blijven na behandeling in water oplosbaar, lipiden worden zelfs opgelost en het weefsel krimpt sterk. Azijnzuur doet het weefsel zwellen en slaat nucleïnezuren goed neer. Trichloorazijnzuur precipiteert (een vaste stof uit een vloeistof laten bezinken door toevoeging van een reagens) eiwitten en nucleïnezuren goed. Picrinezuur ook, maar heeft tevens de neiging om nucleïnezuren te hydrolyseren (splitsen). Kwik en chroom kunnen crosslinks in eiwitten maken. De werking van formaldehyde kan worden beschreven als het leggen van waterstofbruggen binnen en tussen eiwitmoleculen. Om ervoor te zorgen dat het fixatief zo weinig mogelijke nadelige invloeden op het weefsel heeft zijn er naast de enkelvoudige stoffen verschillende combinatie fixatieven ontwikkeld. - Ethylalcohol of Ethanol is een fixatief dat snel inwerkt maar abrupt het water uit het weefsel verdrijft. Het is geschikt voor kleine stukjes weefsel (3-4 mm dikte is in 2-4 uur gefixeerd). De krimp is groot en de buitenzijde van het weefsel wordt snel hard en is ongunstig voor het latere coupe snijden. De samenstelling van eiwitten wordt door ethanolfixatie niet aangetast. In eiwitten ingesloten stoffen zoals slijm en glycogeen blijven intact. Lipiden (vet) en hemoglobine (rode kleurstof van erytrocyt) worden wel uitgespoeld. Ethanol wordt soms toegepast bij een bloeduitstrijk maar hoofdzakelijk in de plantkunde. - Formaldehyde is een stekend ruikend gas dat zich goed in water laat oplossen. De oplossing in water wordt formaline of formol genoemd (vroeger heette het nog wel eens ‘sterk water’). De oplossing penetreert het weefsel goed en is ook geschikt om wat grotere stukken te fixeren. In tegenstelling tot alle andere fixatieven kan een stukje weefsel in formaline enkele maanden verblijven zonder dat de structuur duidelijk verandert. Willen we weefsel langer bewaren dan is het raadzaam om aan het formaline een klein brokje marmer toe te voegen. De reden hiervoor is dat onder invloed van zonlicht en stoffen die uit het weefsel trekken er spontaan mierenzuur gaat ontstaan. Formaline wordt als fixatief vaak in een oplossing van 4% gebruikt. Af en toe is een 37% oplossing vereist. Kijk op oplossen en verdunnen voor een handige tabel. - Zenker is een combinatiefixatief die bestaat uit: Sublimaat (kwikzilver 2 chloride), kaliumbichromaat, natriumsulfaat, ijsazijn en gedestilleerd water. Kijk op oplossingen maken voor de juiste mengverhoudingen. Enkelvoudig sublimaat laat het cytoplasma sterk krimpen maar in verbinding met formaline, ijsazijn, trichloorazijnzuur of chroomzouten telt het tot een van de meest gebruikte fixatieven. Een nadeel van dit fixatief is dat er altijd een neerslag van kwikzilver ontstaat die uit het preparaat moet worden weggehaald. Bij 8. Kleuren gaan we hier verder op in. Na fixatie in Zenker is het preparaat voor veel kleurstoffen uitstekend toegankelijk en bij sommige kleuringen, b.v. Mallory, zelfs noodzakelijk. - Bouin is een combinatiefixatief die bestaat uit: Picrinezuur, formaline en ijsazijn. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Carnoy is een combinatiefixatief die bestaat uit: Alcohol, chloroform en ijsazijn. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Flemming is een combinatiefixatief die bestaat uit: Chroomzuur, osmiumzuur en ijsazijn. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Susa volgens Heidenhain is een combinatiefixatief die bestaat uit: Sublimaat, zout, trichloorazijnzuur, formaline, ijsazijn en gedestilleerd water. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Formaline alcohol is een combinatiefixatief die bestaat uit: Formaline en alcohol. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Formaline sublimaat volgens Heidenhain is een combinatiefixatief die bestaat uit: Sublimaat, natriumchloride, gedestilleerd water en formaline. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Helly is een combinatiefixatief die bestaat uit: Sublimaat, kaliumbichromaat (K2Cr2O7 ), natriumsulfaat, gedestilleerd water en formaline. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. - Stieve is een combinatiefixatief die bestaat uit: Sublimaat, formaline en ijsazijn. Kijk op oplossen en verdunnen voor de juiste mengverhouding. 3. Dehydrateren Na het fixeren moet allereerst worden gespoeld alvorens verder te kunnen gaan. Was bij het weefsel uitnemen leidingwater of aqua dest. absoluut te vermijden, nu het weefsel gefixeerd is is dit niet meer belangrijk. In diverse literatuur is te lezen dat het spoelen net zo lang moet duren dan het fixeren. Der Dokumentenserver der Universitätsbibliothek Philipps-Universität Marburg 1.8.5. Auswaschen der Präparate Das Auswaschen der Präparate erfolgt je nach Art der Fixierung in Leitungswasser oder in Alkohol verschiedener Konzentration. Als allgemeine Regel gibt Romeis264 an, daß nach Fixierung in formol, chrom- oder osmiumhaltigen Lösungen in Leitungswasser gewaschen wird; nach Behandlung in chromfreien Sublimat- oder Trichloressigsäurengemischen in 90-96%igen Alkohol. Präparate, die für elektronenmikroskopische Untersuchungen vorbereitet werden, wäscht man in Pufferlösungen, im allgemeinen im gleichen Puffer, der schon zum Ansetzen der Fixierlösung Verwendung fand. Für die Dauer des Auswaschens gilt als Faustregel, daß das Waschen der Präparate genauso lange wie das Fixiern dauern soll. Bei der gewöhnlichen Formalinfixierung kann man das Auswaschen beschleunigen, indem man in niedrigprozentigem Alkohol wäscht. Hat man daher zu kurz in fließendem Wasser gewaschen, setzt sich der Prozeß einfach auf die ersten Schritte der Entwässerung fort. Der Zusatz von einigen Tropfen Ammoniak zur Spülflüssigkeit beschleunigt das Auswaschens des Formols. Die Anwesenheit von Formalin kann man durch den Zusatz eines Tropfens Schiff`schen Reagens prüfen; wir haben uns bei unseren Untersuchungen darauf beschränkt, die Präparate für 24 Stunden in fließendem Leitungswasser zu waschen. Zoals eerder beschreven moet het weefsel worden ingegoten in paraffine om het goed te kunnen snijden. Om de paraffine tot op celniveau in het weefsel te krijgen zal eerst al het water uit het weefsel gehaald moeten worden. Dit ontwateren (dehydrateren) gebeurt in een stijgende alcoholreeks. De reeks is noodzakelijk om het water langzaam uit het weefsel te verdrijven, gaat het te snel dan tast het de weefselstructuur aan. Er zijn vele soorten alcoholreeksen ontwikkeld die allen voldoen. De door de auteur gebruikte reeks is gebaseerd op het makkelijk te verkrijgen ethanol en isopropanol. De reeks is: 50%, 70%, 85%, 95% en 99,5% (100% ethanol is niet te verkrijgen). Met name de absolute ethanol is vrij duur in aanschaf. De absolute isopropanol is goedkoper en voldoet prima. Het preparaat verblijft ongeveer 12 uur in elk bad. 4. Inbedden in paraffine Nadat alle water in de stap 100% isopropanol uit het weefsel is verdwenen wordt het weefsel ingegoten in paraffine. Voordat dit mogelijk is moet er nog een tussenstap (intermedium) worden gemaakt omdat isopropanol niet in paraffine wil oplossen. Deze stap wordt gemaakt met xyleen of xylol. Het weefsel moet minimaal 12 uur in xyleen verblijven. Na deze intermediumstap volgt een stap met een verwarmde oplossing van 50% xyleen en 50% paraffine. Deze stap moet minimaal 24 uur duren (langer mag). Na deze stap volgt het eigenlijke ingieten in paraffine. Neem een klein kokertje aluminium o.i.d. en smeer dit licht in met glycerine. Giet een dun laagje gesmolten paraffine in het kokertje en positioneer hierin het stukje weefsel zoals het gesneden moet worden. Giet het kokertje nu onmiddellijk vol met gesmolten paraffine. Bij het stollen zal de paraffine sterk krimpen en er ontstaat in het midden van het gietsel een kratertje. Giet dit ook vol met paraffine en zet het geheel in de koelkast om uit te harden. Na ongeveer 1 uur is het geheel hard geworden en kan het blokje uit het kokertje worden geschoven. De glycerine verwijderen met een beetje lauw water. 5. Coupes snijden op handmicrotoom en rotatiemicrotoom De blokjes paraffine met daarin het weefsel kunnen nu met een scherp mes gesneden worden tot een vorm die past op een blokje hout dat in het microtoom gespannen zal worden. De blokjes hout eerst doordrenken met paraffine om een goede hechting met het weefselblokje te verkrijgen. Met een warm gemaakt mes kan nu het blokje weefsel gehecht worden aan het blokje hout. Het lastigste onderdeel van de hele preparatie is het snijden van coupes die dun genoeg zijn om onder een microscoop bekeken te worden. De auteur gebruikt een zelfgemaakt microtoommes die bestaat uit een plaat roestvast staal waarop een kappersscheermes is geplakt. Het plakken van het mes gaat het beste met doorzichtig nagellak. Na verloop van tijd moet het mes vervangen worden en dat kan door de lak op te lossen met een propje poetslap doordrenkt met aceton. Na vele mislukte pogingen moeten er coupes ontstaan die er uit zien als op deze pagina. Een goede coupe is met twee spelden weer af te rollen. Een beproefde methode is om zoveel te snijden dat er twee of drie dekglaasjes mee gevuld kunnen worden. Zo is het mogelijk om twee of drie preparaten te maken en blijft er ruimte om wat te experimenteren met verschillende kleuringen. Het ene preparaat kan veilig met b.v. Giemsa of May-grünwald-Giemsa gekleurd worden en de andere geeft speelruimte voor een moeilijker kleuring b.v. volgens Mallory of van Gieson. Een coupe die dun genoeg is ziet er altijd wat verfrommeld uit. Belangrijk is dat goede coupes apart gehouden worden in b.v. een petrischaaltje. De kans op zoek raken door wegblazen is dan uitgesloten. Gesneden coupes kunnen rustig een paar dagen bewaard worden op een koele plaats. Het is praktisch om de hele hydrateer-, kleur- en dehydrateerprocedure achter elkaar uit te voeren. Het snijden op een handmicrotoom blijft zeer lastig en goede resultaten zijn pas te verkrijgen met een professioneel microtoom. Op de praparaatpagina kan een keuze worden gemaakt uit coupes vervaardigd op beide soorten microtomen. 6. Coupes bevestigen op voorwerpglas De coupes die nu gemaakt zijn, moeten op een objectglaasje worden gebracht. Later zullen ze op ditzelfde glaasje onder de microscoop worden bekeken. Coupes hechten echter niet zonder meer aan het glas (in een later stadium bleek dit toch mogelijk en bleek een betere methode te zijn). Bovendien zullen er nog enkele rigoureuze bewerkingen volgen tbv. het kleuren. Worden de coupes niet goed bevestigd, dan spoelen ze weg en raken verloren. Alle moeite is dan voor niets geweest. Er bestaat gelukkig een goed plakmiddel, dat tevens goedkoop is. Dit middel is eiwit. Het eiwit wordt verdund met glycerol om een dunner laagje te kunnen maken. Er wordt dan gesproken van eiwitglycerol of - met de oude naam die nog steeds algemeen is - eiwitglycerine. Ten behoeve van de houdbaarheid wordt een conserveermiddel toegevoegd, nl. thymol. Dit kunnen we zelf vervangen door tijm te extraheren in de glycerol. De glycerol (enkele ml hoogstens) wordt in een reageerbuis of evt. grote lepel verhit met wat tijm erbij (een of twee mespunten). Stop zodra de glycerol gaat koken. Filtreer door een gewoon koffiefilter en vang de heldere gelige of bruinige vloeistof op. Breek ook een ei en laat wat van het zeer vloeibare eiwit in een kopje of schaaltje lopen. Absoluut geen spatje dooier en liever ook niet het taaiere eiwitdeel. Dit gaat heel gemakkelijk door het ei in een theezeefje te doen. Het zeer vloeibare eiwit druppelt er dan doorheen. Meng nu één deel afgekoelde glycerol met drié delen eiwit en kluts dit goed door elkaar, bv. met een vorkje (bv. 6 ml eiwit met 2 ml glycerol). Er zal schuim verschijnen. Filtreer het mengsel opnieuw door een koffiefilter. Het gedeelte dat er snel doorloopt is geschikt. Deze eiwitglycerine, kan een paar weken in de koelkast bewaard kan worden. Als er troebeling optreedt (even schudden) moet het worden vervangen door verse. De geur zal vrij snel onaangenaam worden (natte hondenlucht), maar dat is geen probleem. Het opplakken van coupes: De coupes moeten nu worden vastgeplakt op het voorwerpglas. Maak het voorwerpglas zeer zorgvuldig schoon met alcohol en veeg het zo schoon dat ook alle stof eraf is (een stofdeeltje dat tussen coupe en glas of coupe en dekglas komt te zitten geeft een zeer hinderlijke afwijking). Er wordt met een tandenstoker, lucifer oid. een heel klein druppeltje eiwitglycerine op het glaasje gebracht. Gewoon indopen en aftikken. Er komt geen druppel maar een klein nat plekje. Dit plekje wordt met een schone vingertop uitgesmeerd over het glaasje, waarbij het lijkt alsof het weggeveegd wordt. Het laagje dat achterblijft is de juiste dikte. Na enkele minuten is het laagje tamelijk droog. Er worden dan enkele druppels (gedemineraliseerd!) water op gebracht. Op dit water worden de coupes gelegd, die er wat kreukelig en verfrommeld uitzagen. Als het glaasje nu op een warmhoudplaatje wordt verwarmd, smelt de paraffine en trekken de zachte coupes mooi vlak op het oppervlak van de druppel. Als de druppel verdampt is, liggen ze keurig op het glas, gehecht door het eiwit. Gaat het te snel, dan kan er tussentijds nog water worden bijgedruppeld. Het oppakken van de coupes gebeurt overigens met een prepareernaald (naald in houder) of met een penseel. Een lange naald alleen voldoet ook goed. Raak de druppel vooral niet aan met naald of penseel, maar leg de coupes op de druppel neer. De bolle zijde van de coupe moet op het water komen, zodat er geen luchtbellen onder komen of stukken dubbelklappen. De coupes die zijn verkregen zullen vermoedelijk vrij klein en los zijn. Met professionele apparatuur kunnen coupes van meerdere vierkante centimeters worden gesneden, die bovendien als linten aan elkaar hangen. In dit geval is het echter geduldwerk om ze één voor één neer te leggen. Denk eraan dat hele kleine flintertjes van minder dan een millimeter toch interessante coupes kunnen zijn! De druppel op het glaasje mag heel groot zijn, soms wel 2/3 van het glaasje. Zorg er echter voor dat de druppel op het glaasje ligt en er niet aan de zijkanten afstroomt. Denk wel aan het formaat van de dekglaasjes. Er kunnen misschien twee dekglaasjes naast elkaar, maar dan mogen er geen goede coupes onder de naad komen. Buiten het gebied van het dekglaasje zijn coupes later niet meer te bekijken en verdwijnen bovendien bij het latere wegkrabben van resten insluitmiddel. Als alles goed verlopen is liggen de coupes uiteindelijk vlak op het glaasje, in een druppel paraffine. Na stolling is de paraffine een soort wazig aura om de coupe heen. Dit is in orde. In de volgende stappen zal de paraffine worden verwijderd. 7. Hydrateren Om het preparaat te kunnen kleuren zal eerst alle paraffine moeten worden verwijderd. Het preparaat wordt in een dalende alcoholreeks naar een waterige omgeving worden gebracht. Om spaarzaam vloeistoffen te gebruiken is het praktisch om kleine kunststof of glazen potjes te gebruiken. Plak er een sticker op zodat je zeker weet wat er in zit (ga je bijvoorbeeld van de 100% isopropanol rechtstreeks naar alcohol 50% dan is het preparaat verloren). Omdat het voorwerpglas rechtop in de vloeistof komt te staan is het raadzaam om de coupes aan het eind van het voorwerpglas te plakken. De dalende reeks bestaat uit xyleen, 100% isopropanol, 96% ethanol, 85% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, gedemineraliseerd water. De preparaten blijven telkens 3 minuten in een bad. Nadat de preparaten in water zijn aangekomen mogen ze hier zeker een kwartier in blijven liggen. Nu kan er gekleurd worden. 8. Kleuren Omdat dierlijke weefsels geen celwanden bezitten, van nature niet kleurrijk zijn en door de fixatie en dehydratie geen kleurstoffen meer bevatten moeten we kleurstoffen toedienen om structuren te kunnen waarnemen. Standaardisering en vergelijkbaarheid van de kleuringresultaten is moeilijk omdat de kleuring afhankelijk is van vele factoren: - Invloed van het soort fixeermiddel - tijdsduur van fixeren - zorgvuldigheid van fixeren - mate van uitspoelen van fixatieven - weefselstructuur - verschillen in concentratie van kleurstofoplossingen - veranderingen die in kleurstoffen optreden door b.v. lichtinvloeden - oplosmiddelen kunnen verdampen uit een kleurstof waardoor de concentratie stijgt - verschillen in kleurtechnieken, invloed van kleurtijd en temperatuur Men onderscheidt twee soorten kleurtechnieken: progressieve en regressieve. Bij een progressieve techniek wordt het preparaat in de kleurstof gezet en gewacht totdat de kleuring op voldoende sterkte is gekomen. Daarbij kan van tijd tot tijd de kleurvordering bekeken worden. Bij een regressieve kleurtechniek wordt het preparaat bewust overkleurd waarna het door een geschikte vloeistof in kleurniveau wordt teruggebracht (dit wordt differentiëren genoemd). Belangrijk hierin is dat de differentiatievloeistof grondig wordt uitgewassen omdat anders de differentiatie doorgaat en een onderkleuring het gevolg is. Verder onderscheiden we nog de directe (substantieve) en indirecte (adjectieve) kleuring. Substantieve kleurstoffen binden zich direct zonder voorbehandeling aan de moleculen. Bij een adjectieve kleurstof moeten we eerst een voorbehandeling uitvoeren om de kleurstof te laten binden. Een kleurstof kan enkelvoudig of meervoudig worden toegediend. Wanneer een kleurstof wordt toegediend, gespoeld en daarna nog een kleurstof wordt toegediend spreken we nog steeds niet van een dubbelkleuring. Een echte dubbelkleuring is een mengsel van twee kleurstoffen die gelijktijdig op verschillende gedeeltes van het preparaat inwerken. Er bestaan driedubbel en zelfs vierdubbele kleuringen. Het resultaat is mede afhankelijk van het aanhouden van de voorgeschreven kleurtijden. Wordt te lang gekleurd dan lopen de kleuren in elkaar over en ontstaat er weer één kleur. Na sommige fixatieven moet voor kleuring het weefsel worden vrijgemaakt van neerslag. Alle sublimaathoudende fixatieven geven een neerslag die verwijderd dient te worden met een jodium-kaliumjodide (lugol) oplossing. Het weefsel moet daarna weer gebleekt worden met natriumthiosulfaat. Soms wordt na een formaldehyde fixatie voorgeschreven om het weefsel te oxideren. Dit doen we met een kaliumpermanganaatoplossing 0,25% die het preparaat lichtbruin zal kleuren (20-30sec) Het ontstane bruinsteen wordt aansluitend weer verwijderd met natriummetabisulfiet of oxaalzuur 3% . De weefsels verliezen dan weer de bruine kleur. Daarna dient met stromend leidingwater goed te worden uitgespoeld. Door op de link te klikken van onderstaande kleuringen zal het protocol verschijnen. Tevens wordt verwezen naar een artikelnummer van Waldeck-Division Chroma PF.410180 48065 in Münster (DLD) waar de kleurstof te verkrijgen is met hoeveelheid en prijs. Soms wordt naar een veiligheidsblad verwezen. Alle genoemde kleuringen zijn ook in een preparaat op deze site te zien of zijn nog in ontwikkeling en zullen te zijner tijd gepubliceerd worden. AZAN kleuring volgens Martin Heidenhain Kleuring volgens Van Gieson Kleuring volgens Frank Burr Mallory Driedubbele kleuring volgens Mann-Dominici IJzer haematoxyline volgens Carl Weigert Eosine-Anilineblau volgens H. Sieben Haematoxyline-Eosine volgens Paul Ehrlich Safranine-Gentianviolet-Lichtgroen volgens Geidies PAS kleuring 9. Preparaat houdbaar maken In de medische wereld worden alle preparaten, na bekeken te zijn, vernietigd. Wij als hobbyisten zullen de preparaten willen bewaren. Daarvoor zijn wederom enkele chemische ingrepen noodzakelijk. De meeste preparaten zullen vanuit een waterige omgeving via een stijgende alcoholreeks weer gebracht moeten worden naar een watervrije omgeving. Dit kan door een reeks potjes met ethanoloplossingen klaar te zetten en de preparaten daar zo’n 3 minuten per potje in te laten staan. Na sommige kleuringen kan direct naar een 100% isopropanol, dan even in de xyleen (kan soms worden overgeslagen) waarna een hars of kunsthars kan worden opgebracht. Het is voldoende om 2 druppels hars rechtstreeks op het door xyleen natte weefsel te druppelen en daarna een dekglas aan te brengen. De hars zal spoedig buiten het dekglas vloeien maar kom er vooral niet meer aan. Op een droge, niet te koude, stofvrije plek, horizontaal laten drogen. Controleer na een paar minuten hoe het dekglas op het preparaat ligt. Wanneer er te veel hars is opgebracht wil het dekglas gaan zwemmen en kan het wel 5 mm opschuiven. Mocht dit gebeuren dan kan met een prepareernaald het dekglas weer in positie worden gedrukt maar het risico bestaat dat het preparaat wordt beschadigd. Veel hars opbrengen is helemaal niet nodig en zelfs onwenselijk. Bij een 40x en zeker bij een 100x objectief komt het objectief zeer dichtbij het dekglas en bij een te dikke laag hars zal het objectief het dekglas raken wat beschadigingen kan veroorzaken. Er zijn enkele soorten hars in de handel die elk hun specifieke voor en nadelen hebben. In 1980 heeft Dr. Dieter Krauter samen met Dr. Ulrich Rüdt een vergelijkingstest uitgevoerd op de meest voorkomende insluitmiddelen. Beoordeeld zijn: DePex, Entellan, Eukitt, Euparal en Malinol. Reeds decennia lang is het natuurlijke hars; Canadabalsem een veel gebruikt insluitmiddel echter heeft het twee nadelen. De zeer lange droogtijd en noodzaak van absolute watervrijheid van het preparaat. Een ander mogelijk nadeel is dat onder de naam Canadabalsem vele harsen worden geleverd zonder duidelijke samenstelling die niet die kwaliteit geven die verwacht wordt. De houdbaarheid van preparaten heeft zich bewezen. De huidige harsen zijn makkelijker in gebruik maar hebben zich nog niet absoluut bewezen. Entellan en Eukitt zijn kunstharsen en bijna identiek. De brekingsindex is met 1,49 te laag waardoor sommige kleuringen een beetje dof overkomen in vergelijk met insluitmiddelen met een hogere brekingsindex. De vloeieigenschappen zijn matig. Doordat de middelen sneldrogend zijn krijgen kleine ingesloten luchtbelletjes niet de kans om via de rand van het dekglas uit de hars te verdwijnen. Het gebeurt niet zelden dat de hars na verloop van jaren gaat barsten. Voordeel van deze middelen is dat ze relatief tolerant zijn met kleine hoeveelheden water die in het preparaat kan zijn achtergebleven (het wordt niet onmiddellijk troebel). Na de 100% ethanol of isopropanol moet wel de xyleen stap gemaakt worden omdat anders sommige kleurstoffen kunnen gaan bloeden. DePex is een kunsthars, heeft een betere brekingsindex dan Entellan en Eukitt maar ook een veel langere droogtijd. Het is moeilijk om met DePex luchtbelvrij in te bedden. Met een fasecontrastmicroscoop laten zich geregeld melkachtige troebelingen zien. De samenstelling van de hars is geheel neutraal dus moet dit een garantie zijn voor een zeer lange houdbaarheid. Euparal is ook een kunsthars maar heeft zeer gunstige eigenschappen. De brekingsindex is met 1,53-1,54 bijna ideaal te noemen. Vlak na het inbedden lijken de preparaten een beetje stompe kleuringen te hebben maar nadat de hars is uitgedampt (6-12 uur) is alles glashelder. De zuurgraad van deze hars is vrij hoog zodat kleuringen die absoluut niet tegen zuur kunnen (haematoxylinen) de houdbaarheid kunnen beïnvloeden. De hars vloeit prima en hecht goed aan het glas. Omdat Euparal oplost in ethanol en isopropanol kan de xyleenstap achterwege blijven wat soms een groot voordeel kan zijn (sommige plantdelen kunnen plotseling de laatste xyleenstap niet verdragen en krullen om). Malinol is net als Canadabalsem een natuurlijke hars van verschillende bomen. De zuurgraad is laag. De brekingsindex met 1,52 gunstig. Malinol vloeit uitstekend, hecht zeer goed aan glas en kleine ingesloten luchtbelletjes verdwijnen vanzelf naar de rand van het dekglas waar ze de hars verlaten. Groot nadeel is de lange droogtijd van 3 tot 6 dagen. Binnen een week kan het preparaat niet op z’n kant worden gezet. In een warmtekast van 60 graden is de hars veel sneller hard (6 tot 12 uur). Echte uitharding is pas na enkele weken. Welke hars het best te gebruiken is zal empirisch (proefondervindelijk) moeten worden vastgesteld. De webmaster werkt met Entellan, Euparal en Malinol maar heeft nog te weinig ervaring om goed te kunnen oordelen. Op een later tijdstip zullen hier de ervaringen worden vermeld. 10. Preparaat afwerken Deze laatste stap is misschien wel de belangrijkste (dit geldt zeker voor de medische wereld). Voordat de preparaten in een speciale doos (zie prepareren) kunnen worden opgeborgen moeten ze worden gedocumenteerd. De webmaster gebruikt een kleine sticker met hoofdgegevens zoals: preparaatnummer, datum, korte omschrijving en soort kleuring. In een database kan via het preparaatnummer meerdere gegevens worden opgezocht zoals: gebruikte chemicaliën, soort fixatief, tijden van fixeren, dehydrateertijden, kleuringstijden, kleurstofssamenstelling, afbeeldingen van het weefsel etcetera). Het voorwerpglas kan nu ook schoongemaakt worden van restkleurstoffen en het overtollige hars dat onder het dekglas uit is gevloeid kan (hoeft niet) weggekrabd worden met een scherp mes.
auteur: Ronald Schulte | www.ronaldschulte.nl | |